Авторы: Н.Н. Иванова, О.В.Митрофанова (Никитский ботанический сад – Национальный научный центр НААНУ, Украина, АР Крым, г. Ялта).
Разработка способов клонального микроразмножения декоративных растений является одним из направлений биотехнологии [1, 2, 3, 5]. В связи с возрастающим интересом к новым растениям, используемым в декоративном садоводстве для озеленения и недостатком высококачественным посадочного материала актуальной становится проблема массового размножения декоративных культур. Эта проблема может быть успешно решена с помощью методов клонального микроразмножения, которые используются не только для выявления общих закономерностей морфогенеза растений, но и в коммерческих целях для получения цветочных горшечных растений.
Род бегония (Begonia L.) относится к одноименному семейству бегониевых (Begoniaceae C. A. Agardh) [8]. Бегонии обладают большим разнообразием форм окрасок листьев и цветков, а также обильным и продолжительным цветением. Основные способы традиционного размножения бегонии листьями и верхушечными черенками можно использовать только осенью и зимой в случае безнематодного содержания маточных растений.
Begonia riger elatior – гибридная форма, которая отличается особой декоративностью. Растения компактные, хорошо облиственные. Цветоносы многоярусные, цветки простые или махровые, чаще оранжево-красных тонов. На хорошо сформированном растении их может быть до 70-80 штук. Для удовлетворения спроса на эти растения недостаточно использовать только традиционные методы размножения и селекции. О возможности клонального микроразмножения B. elatior описано в ряде публикаций [6, 7, 9, 10]. Однако большинство исследований были проведены на отдельных сортах и группах гибридных бегоний.
Целью настоящего исследования было изучение особенностей клонального микроразмножения и массового получения регенерантов двух сортов B. riger elatior.
В качестве объектов исследований были использованы растения B. riger elatior сортов Krefel и Schwabenland. В культуру in vitro вводили высечки листа размером 1 х 1 см. Для стерилизации исходного растительного материала применяли 70 %-ный раствор этилового спирта и 1,0 %-ный раствор гипохлорита натрия. Экспланты B. riger elatior культивировали на агаризованной питательной среде МС [11], дополненной 8,90-11,20 мкМ БАП и 5,14-8,56 мкм ИУК. Высечки листа B. riger elatior содержали в культуральных сосудах на свету с интенсивностью освещения 2-3 клк, 16-часовым фотопериодом, температурой 23-25 °С и относительной влажностью воздуха 70%. Учитывали количество регенерировавших микророзеток.
Укоренение микророзеток B. riger elatior проводили на питательной среде МС, содержащей макро- и микроэлементы в половинной концентрации, дополненной 3,94-7,36 мкМ ИМК, 5,71-11,42 мкм ИУК и 0,54-1,07 мкМ НУК.
На адаптацию in vivo растения высаживали в стерильные субстраты: торф; перлит; торф:перлит (1:1, 2:1); торф:песок (1:1). Адаптированные растения в дальнейшем выращивали в теплице.
При клональном микроразмножении многие авторы отдают предпочтение прямому органогенезу. В этом случае индукция адвентивных почек происходит непосредственно из клеток экспланта. Это гарантирует генетическую идентичность полученных растений родительским формам [4, 5].
Известно, что правильный выбор типа первичного экспланта, метода стерилизации, использование экзогенных регуляторов роста, условий культивирования дают возможность оказывать влияние на процессы морфогенеза в культуре органов и тканей. В процессе исследований установлено, что наибольшим морфогенетическим потенциалом в культуре in vitro обладали высечки листа размером 1 х 1 см (с центральной жилкой) молодых листьев верхней части растения. С увеличением возраста листа регенерационная способность эксплантов уменьшалась. Большое влияние на процессы морфогенеза оказывала и подготовка донорского растения. Выращивание материнских растений при 12-14 °С в условиях короткого дня в течение 3-4 недель с соблюдением определенных правил агротехники обеспечило применение более щадящего способа стерилизации и позволило достичь в дальнейшем активной пролиферации адвентивных почек в культуре in vitro. Применение ступенчатой стерилизации, с использованием 70%-ного раствора этилового спирта (1 мин) и 1,0 %-ного раствора гипохлорита натрия (10 мин) снизило уровень контаминации эксплантов до 20% и повысило частоту регенерации микророзеток до 80 %.
Для B. riger elatior сортов Krefeld и Schwabenland получена прямая регенерация микророзеток в культуре изолированных листовых эксплантов. При этом установлено, что важную роль в индукции прямой регенерации микророзеток имели различные соотношения БАП и ИУК. В наших экспериментах высечки листа помещали на агаризованную питательную среду абаксиально и адаксиально. Данные, представленные на рисунке 1 подтверждают, что концентрация БАП 8,90-11,20 мкМ в сочетании с 5,71 мкМ ИУК были оптимальными концентрациями для адвентивного побегообразования. В присутствии 6,22 мкМ БАП и 5,71 мкМ ИУК, а также 13,30 мкМ БАП и 5,71 мкМ ИУК количество листовых эксплантов, которые образовывали микророзетки достигало 56 % и 88 % соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации регуляторов роста приводило к образованию двух типов каллуса (компактного и рыхлого), что значительно снижало частоту регенерации микророзеток. Формирование микророзеток в условиях in vitro происходило без образования каллуса, что обеспечивало их генетическую стабильность.
В ходе выполнения экспериментов установлено, что положение листовых эксплантов на питательной среде оказывало значительное влияние на частоту регенерации микророзеток 2-х сортов B. riger elatior. Так, максимальный выход микророзеток получен при адаксиальном расположении листовых эксплантов на поверхности питательной среды по сравнению с абаксиальным. Через 8 недель культивирования количество листовых эксплантов, способных к регенерации при адаксиальном расположении достигало 95 % у сорта Schwabenland и 98 % у сорта Krefeld, при этом количество микророзеток составило 25-30 шт. на эксплант.
Исследования влияния основных физических факторов на морфогенез листовых эксплантов B. riger elatior показали высокую эффективность воздействия интенсивности освещения 2-3 клк, температуры 23-25 °С и 16-часового фотопериода при прямой регенерации микророзеток При этих условиях 85,6 % высечек листа сорта Krefeld и 94,6 % сорта Schwabenland активно формировали адвентивные почки и микророзетки. Полученные микророзетки не имели морфологических отклонений.
| Концентрация ИМК, мкМ | Количество корней, шт. | Длина корней, см | Частота укоренения, % |
| 2,95 | 2,89 ± 1,1 | 1,96 ± 1,3 | 35,0 ± 1,9 |
| 3,49 | 3,18 ± 1,1 | 2,12 ± 1,0 | 63,12 ± 1,5 |
| 4,90 | 4,15 ± 1,2 | 2,51 ± 1,2 | 100 |
| 7,36 | 7,86 ± 1,8 | 3,23 ± 1,1 | 45,0 ± 1,9 |
Таблица 1. Укоренение микророзеток B. riger elatior в условиях in vitro на питательной среде с ИМК.
На этапе ризогенеза применяли ИУК, НУК и ИМК в различных концентрациях. Спустя 14 суток культивирования наблюдали 100 %-ое укоренение микророзеток при наличии в питательной среде 4,90 мкМ ИМК (табл. 1). Введение в питательную среду 5,71-11,42 мкм ИУК также стимулировало процесс ризогенеза у 60 % микророзеток, однако в дальнейшем растения погибали на этапе адаптации. Применение 0,54-1,07 мкМ НУК вызывало образование каллуса в основании микророзеток, который препятствовал закладке корней.
На этапе адаптации миниатюрные регенеранты с хорошо развитыми корнями через 6 недель культивирования пикировали в вазоны со стерильным субстратом. Частота приживаемости регенерантов в субстрате, состоящим из торфа и перлита в соотношении 2:1 составила 90 % (табл. 2).
| Тип субстрата | Частота приживаемости, % | |
| сорт Krefeld | сорт Schwabenland | |
| торф | 55,6 ± 3,1 | 53,1 ± 2,8 |
| перлит | 50,0 ± 2,3 | 48,3 ± 3,1 |
| торф : перлит (1:1) | 76,2 ± 2,8 | 74,1 ± 3,2 |
| торф : перлит (2:1) | 90,1 ± 2,6 | 90,0 ±2,8 |
| торф : песок (1:1) | 61,3 ± 2,7 | 59,8 ±2,7 |
Таблица 2. Результаты адаптации регенерантов B. riger elatior на различных стерильных субстратах в условиях in vivo.
Весь процесс от изолирования экспланта до появления полостью сформированного растения длился 3,5-4 месяца. Цветение молодых растений начиналось после достижения ими высоты 12 см.
Таким образом, в результате проведенных исследований были изучены морфогенетические потенции листовых эксплантов 2-х сортов B. riger elatior в условиях in vitro. Установлена зависимость регенерации микророзеток через прямой органогенез от генотипа экспланта, расположения экспланта на поверхности среды, комбинации регуляторов роста. Разработаны условия укоренения in vitro и адаптации in vivo полученных регенерантов.
Список литературы
- Биотехнологические исследования садовых и других ценных многолетних культур. Сб. науч. трудов / Никит. ботан. сад. – 1997. – Т. 119. – 200 с.
- Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. – М.: Наука, 1964. – 270 с.
- Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. – Киев: Наукова думка, 1992. – 232 с.
- Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений – М. : Наука, 1983. – 96 с.
- Митрофанова О.В. Вирусные болезни промышленных цветочных культур и биотехнологические приемы оздоровления. – М.: ВИИТИ, 1992. – Деп. 1729-В92. – 206 с.
- Митрофанова О.В., Иванова Н.Н. Микроразмножение бегонии Элатиор // Цветоводство. – 1986. – № 6. – С. 12-13.
Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitrо. – К. : Наукова думка, 2008. – 559 с. - Шахова Г.И. Бегониевые. – М.: Планета, 1987. – Сер. Комнатные растения. Вып. 3. – 60 с.
- Basal S.K. Ornamental Plant sand Biotechnology. – Iaipur : Book Enclave, 2007. – VIII. – 308 p.
- Jain S.M. Somaclonal variation in Begonia elatior and Saintpaulia ionantha L. // Sci. Hortic. – 1993. – V. 54. – P. 221-231.
- Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays tobacco tissue culture // Physiol. Plant. –1962. – V. 15, № 3. – P. 473-497.